Thomas Hill1, Olga Krougly1, Enayat Nikoopour1, Stacey Bellemore1, Edwin Lee-Chan1, Lynette A Fouser2, David J Hill34 und Bhagirath Singh156 *
* Entsprechende Autor: Bhagirath Singh bsingh@uwo.ca
Autor Zugehörigkeiten 1 Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Universität von Western Ontario, London, ON, Kanada
2 Entzündung und Immunologie, Biotherapeutics Forschung und Entwicklung, Pfizer, Cambridge, MA, 02140, USA
3 Institut für Physiologie und Pharmakologie, University of Western Ontario, London, ON, Kanada
4 Lawson Health Research Institute, London, ON, Kanada
5 Centre for Human Immunology, University of Western Ontario, London, ON, Kanada
6 Robarts Research Institute, University of Western Ontario, London, ON, Kanada
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Zellregeneration 2013, 2: 2 doi: 10.1186 / 2045-9769-2-2
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Empfangen: 25. Januar 2013 Akzeptiert: 2. April 2013 Veröffentlicht am: 4. April 2013 © 2013 Hill et al .; Lizenznehmer BioMed Central Ltd. Dies ist ein Open Access-Artikel unter den Bedingungen der Creative Commons Lizenz verteilt (die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, sofern die ursprüngliche Arbeit richtig zitiert.
Zusammenfassung Hintergrund Bei Typ-1-Diabetes, die Insulin-produzierenden β-Zellen in der Bauchspeicheldrüse Langerhans'schen Inseln zerstört. Wir zeigten früher, dass die Immuntherapie mit Bacillus Calmette-Guerin (BCG) oder komplettem Freund'schen Adjuvans (CFA) von nicht-fettleibigen diabetischen (NOD) Mäusen Krankheitsprozess und den Verlust pankreatischen β-Zellen verhindern kann. Dies wurde mit einer erhöhten islet Regenerierende (Reg) Gene Expression assoziiert und erhöhte IL-22-produzierenden Th17 T-Zellen in der Bauchspeicheldrüse.
Ergebnisse Wir vermuten, dass IL-22 für die erhöhte Reg Genexpression in der Bauchspeicheldrüse verantwortlich war. Wir quantifiziert daher die Reg1, REG2 und Reg3δ (INGAP) Ausdruck mRNA in isolierten vordiabetischen NOD Inselchen mit IL-22 behandelt. Wir maßen IL-22 und IL-22-Rezeptor (R) -α-mRNA-Expression in der Bauchspeicheldrüse und Milz von prädiabetischen und diabetischen NOD Mäusen. Unsere Ergebnisse zeigten: 1) Reg1 und Reg2 mRNA Fluss signifikant in IL-22-behandelten Inseln in vitro erhöht werden; 2) IL-22-mRNA-Expression in der Pre-diabetischen Maus Bauchspeicheldrüse erhöht sich mit der Zeit folgende CFA-Behandlung; 3) eine verminderte Expression von IL-22Rα folgenden CFA-Behandlung; 4) eine Herunterregulierung in Reg1 und Reg2-mRNA-Expression in der Bauchspeicheldrüse von Pre-diabetischen Mäusen injiziert mit einem IL-22 neutralisierenden Antikörper; und 5) eine erhöhte islet β-Zell-DNA-Synthese in vitro in Gegenwart von IL-22.
Schlussfolgerungen Wir schließen, dass IL-22 auf die Regeneration von β-Zellen durch Hochregulieren Regenerierende Reg1 und Reg2-Gene in den Inselchen beitragen.
Stichwort: Die adjuvante Immuntherapie; Interleukin-22; Regenerieren (Reg) Gene; Beta-Zell-Regeneration; Typ-1-Diabetes Hintergrund Typ-1-Diabetes (T1D), auch bekannt als juveniler Diabetes ist eine Autoimmun durch die Zerstörung der Insulin-produzierenden β-Zellen in der Bauchspeicheldrüse Langerhans'schen Inseln Krankheit, charakterisiert. Typ 1-Diabetes wird gedacht, durch eine komplexe Interaktion zwischen Umwelt- und genetischen Faktoren verursacht werden, die noch nicht vollständig verstanden wird [1]. Diese Interaktion bewirkt, dass anfängliche Schädigung der Pankreasinseln zu einer T-Zell-vermittelte Autoimmunreaktion führt, die Fehlregulation und Zerstörung von β-Zellen über die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen [2] induziert. Aktuelle T1D-Management umfasst Insulintherapie und der Bauchspeicheldrüse oder Inselzelltransplantation; Jedoch ist keines dieser Verfahren wird die vollständige Entfernung von diabetischen Komplikationen gewährleisten. Daher schlagen Strategien für alternative und lang anhaltende Ansätze können die endogene Regeneration von Pankreas-β-Zellen zu studierenfür T1D Management [3].
Endogener β-Zellregeneration wird angenommen, entweder durch ganze islet Neogenese (WIN) über die Differenzierung von Vorläuferzellen innerhalb des adulten Pankreas auftreten, oder durch ß-Zellreplikation (BCR) und die Regeneration der neuen β-Zellen aus vorbestehenden β -Cells [3,4]. Die Verwendung von nicht-obese diabetic (NOD) oder Streptozotocin injiziert C57 / BL6 Mäuse als Modell für T1D, mehrere Gruppen haben eine mögliche Rolle für Transkriptionsfaktoren, Wachstumsfaktoren und Regeneration Gene gezeigt β-Zell-Regeneration zu stimulieren. Dies könnte in ganz kleinen Insel neogenesis (WIN) und die anschließende Insulinproduktion und Diabetes Umkehr führen. Einige dieser Kandidaten Faktoren umfassen Pankreas- und Duodenal-Homeobox-1 (PDX-1), Glucagon-like peptide-1 (GLP-1), islet Neogenese-assoziiertes Protein (INGAP) und regenerierende protein 1 und 2 (Reg1 und Reg2) [3 , 5-9]. Vor kurzem hat platelet-derived growth factor (PDGF) auch β-Zellregeneration zu stimulieren über die Aktivierung von Cyclin D1 und Induzieren eines G1 zu S-Übergang des β-Zellen gezeigt wurdeZyklus [10].
Zuvor haben wir gezeigt, dass eine einzige Injektion von Mycobacterium haltigen komplettem Freund'schen Adjuvans (CFA) in NOD-Mäusen eine schützende Wirkung gegen T1D hat durch herunter- Autoimmunität zu regulieren und über die Induktion von verschiedenen regulatorischen T (Treg-Zellen) Wiederherstellen normoglycemia [7, 11,12]. Die Rolle von CFA auf endogene β-Zell-Nachschub, durch histologische Analyse identifiziert werden, bleibt jedoch nach wie vor umstritten und der genaue Mechanismus ist derzeit nicht bekannt [5,7].
Mehrere Gruppen haben die Regeneration Genfamilie (Reg) als ausgedrückt während des Prozesses von WIN und β-Zellregeneration in der Bauchspeicheldrüse [3,5,7,9,12] identifiziert. Es gibt sieben Arten von Reg-Gene in der Maus (befindet sich auf dem Chromosom sechs mit Ausnahme von Reg4), aber nur fünf wurden in der menschlichen Gegenwart gezeigt werden (befindet sich auf dem Chromosom 2) [13]. Die Reg-Proteine durch diese Gene codiert werden, sind C-Typ Lektine, und gefunden wurde, auch in einer Vielzahl von Geweben wie Leber, Niere, Gehirn, Magen-Darm-Gewebe und [3,13] ausgedrückt werden. Sobald sezerniert wirken diese löslichen Proteine in autokriner und / oder parakriner Weise ihre Auswirkungen auf ihre verwandten Rezeptoren auszuüben, wo sie stimulieren kann ein antimikrobielles, entzündungshemmende, anti-apoptotische oder regenerative Antwort in Abhängigkeit vom Gewebetyp [ 3,7,9,13]. In den letzten zehn Jahren Reg1 und Reg3δ (INGAP), ausgedrückt durch β-Zellen und Azinuszellen jeweils wurden mit Pankreas-β-Zellregeneration verbunden gezeigt werden,in der Maus durch Cyclin D1 Aktivierung und β-Zellzyklus fördern [9,13,14]. In jüngster Zeit haben wir gezeigt, dass Reg2 in den Pankreasinseln im wesentlichen hochreguliert ist, insbesondere in den β-Zellen nach adjuvanten Behandlung bei diabetischen und nicht-diabetischen NOD weiblichen Mäusen sowie in C57BL / 6 Mäusen, die mit Streptozotocin behandelt ( STZ). Diese erhöhte Expression Reg2 wurde mit einer Zunahme der Insulinproduktion, eine teilweise Auflösung von Insulitis und eine verbesserte Glukosetoleranztest in STZ-behandelten diabetischen C57BL / 6-Mäusen assoziiert gezeigt werden [5]. Dies führte zu dem Schluss, dass die Regeneration ß-Zelle über die Hochregulierung des Reg2-Gens die Fähigkeit T1D kann in diabetischen Mäusen, die mit CFA immunisiert unter Verwendung einen Weg umzukehren, die Reg1 und Reg3δ ähnlich ist [5,7].
CFA Immunisierung wurde gezeigt, dass CD4 T-Zellen induzieren Th17 Interleukin IL-17, IL-22, IL-10 und IFN-γ in NOD-Mäusen [15] zu erzeugen. Dieses Ergebnis führt zu dem Konzept, das Adjuvans-induzierten Zytokine das Potential haben können Transkriptionsfaktoren zu aktivieren, die Reg-Proteine wie Reg1, Reg2 und Reg3β (PAP1) [7] stimulieren. Unter diesen Zytokinen hat IL-22 von besonderem Interesse, weil sie von CD4 Th17 T-Zellen in Krankheiten wie Hepatitis und entzündlicher Darmerkrankung freigesetzt wird, in dem IL-22-Expressionsniveaus gezeigt wurden die Zellregeneration und das Überleben in Hepatozyten zu fördern und Colonal Epithelzellen. Interessanterweise ist IL-22 wurde ebenfalls kürzlich zum Induzieren Reg-Gen-Expression in den Azinuszellen des Pankreas umgebenden Pankreasinseln [16] gefunden. IL-22 ist ein Mitglied der IL-10-Familie von Cytokinen und das Gen auf dem menschlichen Chromosom 12. Wie IL-17A und IL-17F, IL-22 ist ein Glykoprotein, das an seinen Rezeptor-Komplex bindet (bestehend aus IL liegt -10Rβ und IL-22Rα) alsHomodimer [17,18]. Die IL-22-Rezeptor-Komplex wird in der Bauchspeicheldrüse α und β-Zellen [19] stark exprimiert. Bei der Rezeptorbindung sind die Tyrosinkinasen, JAK und Tyk1 phosphoryliert, welche der STAT3-Transkriptionsfaktors zur Aktivierung führt und die anschließende Hochregulierung der Reg-Gene in der Maus und des Menschen [17,18]. Allerdings hat die mögliche Induktion der Reg Gene über IL-22 in den Pankreasinseln oder NOD-Mausmodell noch nicht untersucht worden.
Diese Studie versuchte, die Effekte von IL-22 auf die Regulation der pankreatischen Reg Gene zu testen, mit einem Fokus auf Reg2, in diabetischen und pre-diabetischen Mäusen NOD Weibchen mit CFA immunisiert. Dies wurde in einem zweistufigen Verfahren durchgeführt: Zum einen durch die direkte Wirkung von IL-22 das Studium auf Reg-Gen up-Regulierung in den NOD-Maus-Pankreasinseln; und zum anderen durch Prüfung, ob CFA Immunisierung könnte regulieren IL-22-Expression in der ganzen Pankreas. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass CFA Immunisierung in pre-diabetischen Mäusen zur Produktion von IL-22 über die Induktion von Th17 Zellen führen würde, und dass das resultierende IL-22 Zytokin ein JAK-STAT3 Signaltransduktionsweg durch Bindung an seinen Rezeptor-Komplex aktivieren würde auf Pankreas-β-Zellen. IL-22-Signalisierung würde dann in der Hochregulation der Reg Genexpression zur Folge haben, die ß-Zellregeneration verbunden sein können und die Auflösung von Hyperglykämie in T1D. Dies erfordert jedoch eine Hemmung von Autoimmunerkrankungen, die Umkehrung der Krankheit zu verhindern.Immuntherapien mit Mycobakterien-Adjuvantien, wie BCG-Impfung haben das Potenzial, diese beiden Ziele zu erreichen [20].
Ergebnisse Rekombinantes IL-22-up-reguliert Reg2 und Reg1 mRNA-Expression in den Pankreasinseln, um festzustellen, ob IL-22 Reg Genexpression, 6 Wochen alten prädiabetischen NOD Maus Inseln wurden isoliert und inkubiert mit rekombinantem IL-22 auf 10 induziert und 50 ng / ml Konzentrationen oder Überständen von Th17 polarisiertem Splenozyten enthaltend IL-17 und IL-22 [15] (Abbildung 1). Quantitative RT-PCR wurde auf dem Gesamt extrahierter RNA aus den behandelten Pankreasinseln durchgeführt. Reg2 und Reg1 mRNA-Spiegel durch deutlich höher sein, etwa 3 und 4,2-fach bzw. in Inselchen inkubiert mit 10 ng / ml IL-22 im Vergleich zur Mediensteuerung (P <0,05) (1A und 1B) gefunden wurden, . Interessanterweise ist die höhere 50 ng / ml Dosis von IL-22 signifikant herunterreguliert Reg2 und Reg1 Ausdruck (P <0,05). Dies war auf die Toxizität des Zytokins aufgrund da es keine Änderung in der Lebensfähigkeit der behandelten Zellen zu Inselchen Medienkontrolle verglichen wurde. Die höchste fache Steigerung der Reg2 Genexpression warmit den Überständen von 4 Tagen behandelten Kultur von BDC2.5 NOD Splenozyten konditionierten mit IL-23 und IL-6 (1A) in Inseln beobachtet. Die Überstände enthielten auch IL-22 und eine signifikante 27-fachen Anstieg der mRNA Menge Reg2, wenn an die Mediensteuerung (P <0,05) verglichen. mit der Th17 T-Zellüberstand behandelt Inselchen zeigte auch eine signifikante Hochregulation der Genexpression Reg1 um etwa 4,3-fach, wenn an die Steuer Inselchen verglichen (P <0,05) .Allerdings, im Gegensatz Reg2, Reg1 war Expression nicht signifikant verschieden, wenn im Vergleich zu Inselchen mit 10 ng / ml rekombinantem IL-22 behandelt. Keine signifikante Änderung in Reg3δ Expression wurde in Reaktion auf IL-22 oder dem Th17 T-Zell-Überstand (1C) beobachtet. thumbnailFigure 1. Reg Gene und IL-22-Rezeptor (IL-22Rα) Expression in den Inselzellen der Bauchspeicheldrüse nach IL-22-Behandlung. Quantitative RT-PCR-Analyse wurde unter Verwendung von genspezifischen Primern (Tabelle 1) für Reg1, Reg2, Reg3δ und IL-22Rα auf Gesamt-RNA durchgeführt, isoliert aus6 Wochen alte Pankreasinseln (A-D). Kleine Inseln wurden 48 Stunden nach der Inkubation geerntet entweder mit DMEM-Medium (Kontrolle); 10 oder 50 ng / ml rekombinantem IL-22; oder ein Überstand von Zellen Th17 polarisiert mit IL-6 plus IL-23 (2 ml). Die Ergebnisse stellen die mittlere fold change in mRNA-Expression ± SEM gezeigt, wenn die Kontrolle behandelten Inseln verglichen. N = 3 Mäusen (12 bis 14 Inseln pro Maus). Mittel, mit dem Sternchen (*) gekennzeichnet sind signifikant unterschiedlich (P <0,05). Die Wirkung von rekombinantem IL-22 und dem Th17 Zellüberstand auf IL-22-Rezeptor-Expression wurde auch auf die gleiche islet Proben unter Verwendung von genspezifischen Primern für die IL-22-Rezeptor-Kette, IL-22Rα getestet. Wie in Figur 1D gezeigt, haben die mittleren mRNA-Spiegel für IL-22Rα nicht mit 10 ng / ml rekombinantem IL-22 und in der Tat wurde weiter reduziert mit 50 ng / ml IL-22 behandelt, in Inselchen erhöhen. Inselchen mit dem Th17 Zellüberstand behandelt, um eine signifikante 2,4-fachen Anstieg der IL-22Rα-Expression induziert, wenn im Vergleich zur Kontrolle behandelten Inselchen (Kontrolle[1,36 ± 0,21], Th17 T-Zellen [3,72 ± 0,98], p <0,05). CFA-Behandlung erhöht sich die relative mRNA-Expression für IL-22 in Pankreasgewebe Wir haben zuvor gezeigt, dass die CFA-Injektion in nicht-diabetischen und diabetischen NOD-Mäusen führt zu einer wesentlichen Zunahme in Reg Genexpression [5]. Um festzustellen, ob die Entwicklung von Diabetes durch ähnliche Veränderungen in IL-22-Gen-Expression in vivo, qRT-PCR-Analyse wurde begleitet wurde mit-IL 22-Gen-spezifischen Primer durchgeführt für cDNA, die verschiedenen NOD-Maus-Behandlung / Altersgruppen verwenden. Wie in 2A einen signifikanten Einfluss des Alters gezeigt auf IL-22-Expression wurde (F = 6,374; df = 3; P = 0,021) festgestellt. Post-hoc-Analyse zeigte IL-22 mRNA-Häufigkeit in der Bauchspeicheldrüse in diabetischen Mäusen signifikant höher zu sein, als im Vergleich zu nicht-diabetischen (4 Wochen alt), Tieren (p <0,05). Die mittlere IL-22-Expression in den neigten prädiabetischen (8 Wochen alt) in Mäusen und diabetischen Mäusen nach der CFA-Behandlung höher (um etwa 2 bis 4-fach beziehungsweise). 2 thumbnailFigure.Expression von IL-22 und IL-22-Rezeptor (IL-22Rα) in den pankreatischen Inselzellen nach CFA Immunisierung. Die relativen mRNA-Expressionsniveaus von IL-22 und IL-22Rα (A und B) wurde in der Bauchspeicheldrüse von nicht-diabetischen (4 Wochen alt), pre-diabetic (8 Wochen alt oder 12 Wochen alt) durchgeführt wird, und älter (> 16 Wochen alt) diabetischen NOD-Mäusen nach CFA Immunisierung. Weibliche NOD-Mäuse wurden i.p. mit entweder 100 ul CFA in Kochsalzlösung emulgiert oder mit Kochsalzlösung allein und geopfert zu 48 Stunden nach der Immunisierung. Whole Pankreasgewebe wurde homogenisiert und die Gesamt-RNA für die reverse Transkription quantitative Echtzeit-PCR-Analyse unter Verwendung von Gen-spezifischen Primer extrahiert. Die Ergebnisse für jede Behandlung und Altersgruppen gezeigt haben bis 4 Wochen alten Kochsalzlösung behandelten Mäusen und stellen den Mittelwert fache Veränderung der mRNA-Expression ± SEM verglichen. Die relative Expression von mRNA wurde aus drei gepoolten Proben von RNA pro Gruppe (mit drei Mäuse pro Sammelprobe) entnommen. Altersgruppen durch einen Doppel Sternchen (**) sindsignifikant unterschiedlich (P <0,05); Behandlungen mit dem Sternchen (*) gekennzeichnet sind signifikant verschieden von der Kontrollkochsalzlösung (P <0,05). CFA-Behandlung herunterreguliert Pankreas Expression des IL-22-Rezeptor-Untereinheit, IL-22Rα Es wurde bereits früher von Shioya et al. [19], dass die IL-22Rα-Kette, ein Mitglied der IL-22-Rezeptorkomplex wird in der α- und β-Zellen im menschlichen Pankreas spezifisch exprimiert. Um zu bestimmen, ob CFA-Behandlung die relativen mRNA-Expressionsniveaus von IL-22Rα in der NOD Maus Bauchspeicheldrüse betroffen, qRT-PCR-Analyse wurde von nicht-diabetischen (4 Wochen alt), pre-diabetic (8 Wochen unter Verwendung von Gesamt-RNA extrahiert durchgeführt -old und 12 Wochen alt) und diabetischen Mäusen (2B). (; Df = 3; P = 0001 F = 6,146) eine signifikante Wechselwirkung zwischen Maus Alter und Behandlung mit CFA identifiziert. Wenn die Variablen separat zu analysieren, wurde CFA Behandlung Ausdruck, wenn sie den mit Salzlösung behandelten Kontrollen für alle Maus Alter im Vergleich zu deutlich herunterregulieren IL-22Rα mRNA gefunden(F = 82,411; df = 3, p <0,001) (2B). (; Df = 3, p <0,001 F = 24,212) IL-22Rα mRNA-Expression wurde auch mit dem Alter signifikant verändern gefunden. Post-hoc-Analyse zeigte IL-22Rα mRNA Fluss signifikant höher zu sein in diabetischen Mäusen (P <0,05) im Vergleich zu nicht-diabetischen und pre-diabetischen Mäusen. Pre-diabetischen Mäusen in 12-Wochen alt waren fand eine IL-22Rα mRNA Fluss zu haben, die signifikant niedriger (p <0,05) war, im Vergleich zu nicht-diabetischen (4 Wochen alt), prä-diabetischen (8- Wochen alt) und diabetische Tiere. Reg2 und Reg1 Expression herunterreguliert in CFA-behandelten Mäusen nach der Behandlung mit einem IL-22 neutralisierende Antikörper, ob IL-22 wurde direkt in der Hochregulierung der Reg-Expression nach CFA-Behandlung, die Fülle von REG2 Reg1and Reg3δ beteiligt Um zu bestimmen, mRNAs wurden später in der Bauchspeicheldrüse von 6 Wochen alten NOD-Mäusen, immunisiert mit CFA, gefolgt von ip Injektion einer IL-22 neutralisierende Antikörper 1 h gemessen. Mäusen, die mit CFA immunisiert wurden und mit der IL-22 neutralisierende Antikörper behandelten[21] Es wurde gefunden, eine signifikante Reduktion zu haben (etwa 480-fach) in Ausdruck Reg2 Gen wenn an Mäuse verglichen mit CFA immunisiert und mit einem Isotyp-Kontrollantikörper (P <0,001) (Figur 3A) behandelt. Ebenso war Reg1 Genexpression signifikant herunterreguliert in Mäusen, die mit der IL-22 neutralisierende Antikörper injiziert (P <0,001) (Figur 3B). Im Gegensatz dazu wurde bei Mäusen keine Veränderung in Reg3δ Expression jedoch beobachtet, die mit CFA in Gegenwart von IL-22 neutralisierende Antikörper immunisiert wurden, im Vergleich zu Mäusen, die mit dem Isotyp-Kontrollantikörper (3C) injiziert. thumbnailFigure 3. Expression von Reg-Gene in den pankreatischen Inselzellen nach IL-22 neutralization.Reg1, Reg2 und Reg3δ Genexpressionsniveaus (AC) wurde in der Bauchspeicheldrüse von 6 Wochen alten NOD-Mäusen, immunisiert mit CFA bestimmt und mit einem behandelten IL-22 neutralisierende oder ein Kontroll-Antikörper. Weibliche NOD-Mäuse wurden i.p. mit entweder 100 & mgr; l CFA in Kochsalzlösung mit 100 & mgr; l IL-22 neutralisierende Antikörper (IL-22-01) 1 h emulgiert, gefolgtspäter, oder 100 ul CFA in Kochsalzlösung emulgiert von 100 ul Isotypkontrollantikörper gefolgt. Die Mäuse wurden 48 Stunden nach der Immunisierung geopfert. Whole Pankreasgewebe wurde homogenisiert und die Gesamt-RNA für die reverse Transkription quantitative Echtzeit-PCR-Analyse unter Verwendung von Gen-spezifischen Primer extrahiert. Die Ergebnisse für jede Behandlung gezeigt wurden an Mäuse verglichen mit CFA und dem IgG-Isotyp-Antikörper immunisiert und stellen den Mittelwert fache Veränderung der mRNA-Expression ± SEM. Die relative Expression von mRNA wurde aus drei Mischproben pro Gruppe (mit drei Mäuse pro Sammelprobe) entnommen. Behandlungen mit dem Sternchen (*) gekennzeichnet sind, deutlich verschieden von der CFA-Steuerung (P <0,001). IL-22 und Reg-mRNA-Expression in der Milz Da die Milz ein Haupt peripheren lymphoiden Gewebe ist, führten wir quantitative RT-PCR-Analyse auf Splenozyten abgeleitet von 4-Wochen alten, pre-diabetischen NOD Mäusen mit oder ohne CFA-Behandlung, zu die Anwesenheit von IL-22-produzierenden Zellen zu untersuchen Th17 währendAutoimmun Insulitis (Abbildung 4). CFA-Behandlung wurde deutlich hochregulieren IL-22-Expression in nicht-diabetischen gefunden, 4 Wochen alten Mäusen, die durch etwa 12-fache (p <0,05). Um zu bestimmen, ob CFA-vermittelte Reg-Gen Hochregulation in der Milz aufgetreten sowie in Pankreasgewebe, Reg1, Reg2 und Reg3δ mRNA-Expression wurde auch in ganzen Milzgewebe unter Verwendung von nicht-diabetischen Mäusen mit / ohne CFA-Injektion analysiert. Ähnlich wie Huszárik et al. [5] wurde auf Reg-mRNA-Expression keine Wirkung der Behandlung festgestellt (Daten nicht gezeigt). thumbnailFigure 4. Expression von IL-22 in der Milz von 4 Wochen alten nicht diabetischen NOD Mäusen nach der CFA-Behandlung. Die relative mRNA-Expression von IL-22 in der Milz von 4 Wochen alten NOD-Mäusen wurde nach durchgeführt CFA-Behandlung. Quantitative RT-PCR-Analyse wurde unter Verwendung von genspezifischen Primern (Tabelle 1) auf die Gesamt-RNA aus ganzen Milzgewebe von weiblichen NOD-Mäusen injiziert i.p. getrennt durchgeführt mit entweder 100 ul CFA emulgiert in Salzlösung oder allein Kochsalzlösung. Ergebnisse gezeigtrepräsentieren die durchschnittliche fold change in mRNA-Expression ± SEM im Vergleich mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen. Ergebnisse von 3 Mäusen pro Behandlung. Das Sternchen (*) bezeichnet einen signifikanten Unterschied von der Kochsalzkontrolle (P <0,05). CFA Behandlung nicht Reg oder IL-22-mRNA-Abundanz Veränderung in der immundefizienten NOD.Scid Maus Bauchspeicheldrüse den Befund zu überprüfen, indem Huszárik et al. [5], dass Reg Hochregulierung folgende CFA Behandlung wird durch eine Infiltration T-Zellantwort vermittelt , qRT-PCR-Analyse wurde an der Bauchspeicheldrüse von CFA durchgeführt behandelten nicht-diabetischen (4 Wochen alt) NOD.Scid Mäusen. NOD-schwere kombinierte Immunschwäche (SCID) Mäuse haben eine schädliche single nucleotide polymorphism (SNP) in dem Gen, das Prkdc letztlich T- und B- Lymphozyten-Entwicklung wirkt. Wie von Huszárik et al. [5], wir keine Zunahme in Reg1, Reg2 oder Reg3δ mRNA Menge in der Bauchspeicheldrüse von NOD.Scid Mäusen nach der CFA-Behandlung festgestellt (Daten nicht gezeigt). Dieses Verfahren wurde unter Verwendung von IL-22-Gen-spezifischen Primern wiederholt, um zu bestätigen, dassIL-22 war ein Produkt von Th17 T-Lymphozyten, und wurde nicht durch den Bauchspeicheldrüsenzellen exprimiert. Wie erwartet, IL-22-mRNA-Expression nicht in CFA behandelten Mäuse NOD.Scid geändert hat (Daten nicht gezeigt). IL-22-Behandlung induziert islet β-Zell-DNA-Synthese in vitro zu bestimmen, ob IL-22 kann die DNA-Synthese in islet β-Zellen zu fördern, wir immunhistochemische Analyse auf isolierten Inseln von 5 bis 6 Wochen alten NOD Mäusen mit rekombinantem IL behandelten -22 (10 ng / ml) für 48 Stunden und für die Kern EdU und zytoplasmatische Insulin (5A und B) gefärbt. Der Prozentsatz der positiven EdU β-Zellen wurde mit rekombinantem IL-22 behandelt, in Inselchen signifikant höher zu sein, als im Vergleich Inselchen mit Medien behandelt zu steuern allein (P <0,001) (Figur 5C). Um die Ergebnisse für die DNA-Synthese bestätigen, Dias, die IL-22 behandelten Inseln wurden für die Kern Ki / 67 Protein gefärbt, die mit der Zellproliferation assoziiert ist. Die Inseln wurden gefärbt mit Maus anti-Ki / 67 gefolgt von einer Inkubation mit sekundärem Antikörper. Die positiveExpression von Ki / 67 in den Inseln die Induktion von islet β-Zellen durch IL-22 (Daten nicht gezeigt) bestätigt. Die Fähigkeit von IL-22 den Prozentsatz der β-Zellen, die eine DNA-Synthese zu erhöhen, wie durch Kern Markierung mit EdU detektiert wurde inverser Beziehung Größe Insel (y = -29logx 56, r2 = 0,31, p <0,001, n = 46). Islet Größe wurde von der Gesamtzahl von Insulin-immunreaktiven β-Zellen, die pro Inselchen in Gewebeschnitten geschätzt. Keine solche Beziehung existiert zwischen islet Größe und den prozentualen Atom Kennzeichnung β-Zellen mit EdU zur Steuerung Inkubationen (y = 2.2logx 4,3, r2 = 0,01, nicht signifikant, n = 26). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die mitogenen Wirkungen von IL-22 auf β-Zellen für die kleineren Inseln größten waren. thumbnailFigure 5. Nachweis von Pankreas-Insel Regeneration nach IL-22-Behandlung. Immunofluoreszenz-Lokalisierung von Kern EdU und zytoplasmatische Insulin innerhalb Pankreasinseln wurde in 5 bis 6 Wochen alten NOD-Mäusen durchgeführt. Inselchen wurden entweder mit DMEM-Medium allein (A) oder 10 behandeltng / ml rekombinantes IL-22 für 48 Stunden (B) (rot = EdU; grün = Insulin; blau = DAPI). Beispiele von zweifach markierten Zellen sind mit Pfeilen dargestellt. Die Größe bar = 50 & mgr; m. (C) Der mittlere Prozentsatz ± SEM von β-Zellen immun für beide EdU und Insulin gegenüber allein Insulin. Die Ergebnisse wurden von 26 Kontroll Inseln und 46 IL-22-behandelten Inseln, die von 4 Tieren für jede Gruppe genommen. Das Sternchen (*) bezeichnet einen signifikanten Unterschied von der Kontrolle (P <0,001). Wie im Methodenteil beschrieben ist, in parallelen Experimenten wir die Kernexpression von Ki / 67 als Maß für die Inselzellproliferation untersucht (Daten nicht gezeigt). Dies bestätigte ferner die Verbreitung von Inselzellen von IL-22-Behandlung. Diskussion Wir haben bereits gezeigt, dass mit CFA jungen NOD-Mäusen immunisieren kann dazu führen, Autoimmun- und reduziert insulitis Regeneration von Pankreas-β-Zellen durch Herunterregulierung [5,11,12]. Jedoch sind die zellulären Mechanismen, durch die CFA Lage ist, eine regenerative Antwort zu initiieren sind nicht gut verstanden[7,11]. Vor kurzem CFA-Behandlung in NOD-Mäusen wurde, die als ein wichtiger Kandidat für regenerative β-Zellen gezeigt, im wesentlichen, also während des Regenerations Insulitis Gen, Reg2, in Pankreasinseln hochregulieren [5]. Das Ziel dieser Studie war es, festzustellen, ob die CFA-induzierte Zytokin, IL-22, teilweise zur Induktion Reg2 Expression und andere Gen Familienmitglieder, Reg1 und Reg3δ verantwortlich war, was zu einer späteren Erhöhung des β-Zellmasse und Umkehrung T1D Entwicklung. Der genaue Mechanismus, CFA-induzierte Reg-Gen upregulation Basiswert ist nicht eindeutig definiert. Versuche in der Vergangenheit haben gezeigt, IL-6 ein Zwischenprodukt für Reg2 und Reg1 Geninduktion in der Bauchspeicheldrüse zu sein, da das IL-6 stromauf response element unter diesen Reg Genen konserviert ist [5,22]. Da IL-6 Signalisierung zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren Stat3 Inneren Zielzellen führt [23], wurde angenommen, dass Reg2 Geninduktion auch Stat-3-vermittelten [7]. Unsere Ergebnisse bestätigen und die Rolle erweiterndes Cytokins, IL-22, in Hochregulieren des Reg2-Gens sowie Reg1, damit unsere ursprüngliche Hypothese unterstützen. Wir bestätigten eine 3-fache und 4,2-fache Erhöhung der Reg2 und Reg1 Genexpression jeweils bei prädiabetischen (6-Wochen alt) Pankreasinseln für 48 Stunden mit 10 ng / ml rekombinantem IL-22 in vitro inkubiert wurden. Wir haben zuvor gezeigt, dass die PCR-Ergebnisse für die Expression von Reg-Gene in den Pankreasinseln in unseren Studien korreliert mit der Expression von Reg-Proteinen durch Western-Blot-Assay unter Verwendung von [5]. Dies legt nahe, dass Reg2 Genexpression, wie Reg1, kann über Stat3 Signalisierungs induziert werden, und daß IL-22 kann für die Induktion dieser Gene Reg innerhalb der Pankreasinseln während Insulitis [7,16] (Abbildung 6 eine Immunantwort-vermittelten Mittel sein ). Diese Feststellung wird von einer früheren Studie von Aggarwal et al unterstützt. [16], der hatten gezeigt, dass die in vivo Injektion von IL-22 in einer schnellen Induktion von Reg2 Expression in der Bauchspeicheldrüse von C57 / BL6-Mäusen führte. Interessanterweise wurde in unseren in vitrostudieren rekombinantem IL-22 in einem merk geführt Herunterregulierung der Reg2 und Reg1 Expression in den Inseln von 6 Wochen alten NOD-Mäusen, wenn sie mit hohen Konzentrationen (50 ng / ml) von IL-22 inkubiert. Dies könnte darauf hindeuten, dass pankreatischen β-Zellen zeigen eine dosisabhängige Reaktion auf IL-22, und daß ein Überschuß des Cytokin hemmenden sein kann Reg Genexpression Insel. Im Gegensatz zu den anderen Reg Gene, wurde die Expression von Reg3δ nicht durch IL-22-Behandlung in den Pankreasinseln betroffen und bestätigt damit frühere Studien zeigen Reg3δ Ausdruck in der α- und β-Zellen fehlen. Wir Reg2 und Reg1 Expression werden drastisch reduziert in der Bauchspeicheldrüse von prä-diabetischen Mäusen auch mit einer Neutralisations IL-22-Antikörper injiziert gefunden, was bestätigte, dass IL-22 eine stromaufwärts Aktivator für diese Gene Reg. Diese Ergebnisse unterstützen die Studie von Zhang et al. [24], die die Reg1 und Reg2 Gene gefunden durch IL-22 induziert werden in den Kolonepithelzellen von Citrobacter rodentium-infizierten WT-Mäusen, aber für die Expression zu seinin IL-22 Knock-out-infizierten Mäusen vollständig abgeschafft. Wie unsere Studien mit Th17 Überstand gezeigt, andere Zytokine als IL-22 kann auf die Hochregulation von Reg Gene beitragen. Wir prüfen derzeit diese Möglichkeit in unserem Labor. thumbnailFigure 6. Ein Modell für die Zytokin-vermittelte Hochregulation der β-Zellen-Reg-Gene führt Regeneration zu ß-Zelle. Interleukin-22 (rot) bindet an seinen Rezeptor-Komplex, IL-22Rα / IL-10Rβ, die die Stat3 Transkriptionsfaktor Protein aktiviert (1), STAT3 wandert dann in den Kern der β-Zellen und stimuliert die Reg-Gen-Transkription und Translation ( Grün). Abgesonderte Reg-Proteine werden dann gedacht, um Cyclin D1 aktivieren. Dies ermöglicht die β-Zelle, die die G1 / S-Übergang des Zellzyklus zur Regeneration führt zu betreten. IL-22 kann auch der MAP3 Kinasen Cyclin D1 (2) führt, was wiederum das Retinoblastoma (Rb) inaktiviert. Platelet-derived growth factor (PDGF) (blau) führt in ähnlicher Weise die Aktivierung von Cyclin D1, die wiederum Rb inaktiviertso dass die Freisetzung von sequestriert Transkriptionsfaktoren (TF) essentiell für die G1-S Fortschreiten des Zellzyklus. Reg2 Genexpression durch Stat3 Aktivierung vermutlich durch Rezeptor-induzierte Src-Kinase-Aktivität verursacht werden. Die bekannten Signalwege (schwarz und blau) und die vorgeschlagenen Signalwege (grün) werden identifiziert. Verwendung des gesamten Pankreas von NOD-Mäusen, Huszárik et al. [5] mehrere Mitglieder der Reg-Genfamilie gefunden hochreguliert mit dem Alter zu sein, und Reg2 weiter in diabetischen Mäusen nach der CFA-Behandlung hochreguliert werden. Unsere Ergebnisse stützen die Erkenntnis, dass Reg2 spielt eine dominante Rolle bei endogenen β-Zell-Regeneration nach adjuvante Immuntherapie. Reg2 mRNA-Spiegel wurden in pre-diabetischen Mäusen mit dem Alter allmählich erhöht gefunden und wurden in diabetischen Mäusen nach Immunisierung CFA erhöht [5]. Ähnlich wie bei Reg2, IL-22-Gen-Expression allmählich mit vordiabetischen Alter erhöht und wurde auch in beiden Prädiabetes folgenden CFA Behandlung erhöht und nach dem Einsetzen vonDiabetes. Die ähnliche Expressionsmuster zwischen Reg2 und IL-22 nach der CFA-Behandlung schlägt weiter vor, Reg2 ein Gen Ziel in der IL-22-Signalwegs ist. Doch im Gegensatz zu IL-22, die Expression der Rezeptor-Kette, IL-22Rα fiel unerwartet in allen Altersstufen folgenden CFA-Behandlung. In einer Studie analysiert Wachstumsmantelzelllymphom von IL-22 verursacht wird, Gelebart et al. [25] festgestellt, dass das Gen Promotor zur IL-22Rα enthalten mehrere Bindungsstellen für NF-kB, ein Transkriptionsfaktor, wenn trägt zur Pathogenese aktiviert und fortschreitenden Verlust von pankreatischen β-Zellen, die durch reaktive Sauerstoffspezies zu erzeugen und β-Zell-Apoptose zu fördern. Es ist daher möglich, daß die Wirkungen von CFA kann auf die Störung oder Verschlechterung des NF & kgr; B führen, die wiederum zu reduzieren / verhindern IL-22Rα würde. CFA, ob die Integrität der NF & kgr; B betrifft, würde erfordern jedoch weitere Untersuchungen. Alternativ IL-22-Bindungsprotein (IL-22BP) kann im Umlauf mit dem Alter zu erhöhen und hemmen die Expression vonIL-22-Rezeptors in der Bauchspeicheldrüse. In der Milz, fanden wir Reg-mRNA-Spiegel nicht anwesend sein, so die Feststellung von Huszárik Unterstützung et al. [5], dass die Reg Gene Pankreas-spezifischen mit / ohne CFA Behandlung. Im Gegensatz zu Reg2 Expression jedoch wurden die IL-22-mRNA-Spiegel in Splenozyten gefunden in nicht-diabetischen (4 Wochen alt) NOD Mäusen nach der CFA-Injektion erhöht werden, was die Feststellung Nikoopour bestätigt et al. [15] dass IL-22 ist ein Sekret durch CFA induziert. Wir haben festgestellt, IL-22 als Reg-Gen-Induktor in der NOD-Maus-Pankreasinseln. Reg-Proteine fungieren als autokrine / parakrine Wachstumsfaktor für Bauchspeicheldrüsen β-Zellregeneration. Sie erhöhen die ATF-2, die mit dem Cyclin-D1-Gen bindet und führt zu Signalweg β-Zellregeneration [26] zu induzieren. Es ist auch wichtig zu beachten, dass wie PDGF [10] und Reg1 [9,13], IL-22 durch Radaeva gezeigt wurde, et al. [27] bei der Förderung der Zellzyklus-Progression und das Überleben der Zellen direkt beteiligt zu sein. Mit In-vitro-Behandlung von rekombinantenIL-22 in einer Konzentration ähnlich unserer eigenen Studie von 10 ng / mL, Radaeva et al. [27] konnte das Zellwachstum und das Überleben von menschlichen hepatozellulären Karzinoms HepG2-Zellen über die Aktivierung einer Reihe von anti-apoptotischen und mitogenen zu fördern Proteine, die enthalten: Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, c-myc, und Cyclin D1. Aufgrund der Ähnlichkeit zwischen ontologischen Leberzellen und Pankreaszellen, untersuchten wir auch die Wirkung von IL-22 auf das Wachstum Pankreasinselzelle. Wir fanden eine erhöhte DNA-Synthese in den IL-22 behandelten Inselchen. Das Ausmaß, in dem diese Erhöhung auf die Produktion von Reg2 oder Reg1 von diesen Inseln abhängig war, wird jedoch erfordern weitere Untersuchungen. Die mitogene Wirkung von IL-22 war größer auf den kleineren Inseln, was darauf hindeutet, dass diese Population von β-Zellen können eine größere Regenerationsfähigkeit haben. Smukler et al. [28] berichteten über eine Subpopulation von Insulin-exprimierenden β-Zellen befindet sich in kleinen Inseln sowohl in der Maus und des Menschen Bauchspeicheldrüse, die eine hohe mitogene Potential hatte, aber tatnicht die Glukosetransporter-2 exprimieren. Diese Zellen wurden als lineage multipotent und in der Lage gezeigt, multipler islet endokrinen Zelltypen bilden, sowie neurale Zellen, und kann eine β-Zell-Vorläuferpopulation dar, die dazu beitragen kann die Regeneration zu Insel. CFA-behandelten diabetischen NOD Mäusen zuvor teilweise gezeigt worden T1D umkehren durch Herunterregulierung der Autoimmunität und Stimulieren endogener β-Zellregeneration durch einen Mechanismus, der derzeit unbekannt ist. Dieser Regenerationsprozess ist jedoch nicht genug, um die Krankheit vollständig zu verhindern, wie neu regenerierten β-Zellen werden durch laufenden Autoimmunität noch selektiv zerstört, doch wird angenommen, dass die mitogene Reg-Genfamilie zu involvieren. Wir haben gezeigt, dass das Zytokin IL-22 können bis zu regulieren Reg2 und Reg1 Ausdruck, wenn sie direkt co-kultiviert mit Pre-diabetischen Pankreasinseln in vitro. Somit stellt IL-22 eine neu entdeckte Vermittler für Hochregulierung Insel Reg Ausdruck einer JAK / STAT3-Signaltransduktionsweg verwenden. Wirhaben auch gezeigt, dass überschüssiges IL-22 eine hemmende Wirkung auf islet Reg Expression haben kann, dass die mRNA-Spiegel für IL-22 sind hochreguliert mit dem Alter und der Entwicklung der Krankheit in der NOD Maus Erhöhung dass CFA-Behandlung eine Herunterregulierung bewirkt des IL-22Rα Rezeptorkette, und das IL-22 β-Zell-DNA-Synthese zu erhöhen, wenn pankreatischen Inseln in vitro direkt angewendet. Zusammenfassend hat diese Studie das Cytokin, IL-22, identifiziert in beteiligt sein up regulierende Reg2 und Reg1 Gen Familienmitglieder und β-Zell-DNA-Synthese in pankreatischen Inseln erhöhen. Dies könnte in Inseln β-Zellregeneration führen und dass möglicherweise in zukünftige therapeutische Strategien für Disease-Management bei Typ-1-Diabetes aufgenommen werden könnte. Methoden Tiere Weibliche NOD / Ltj Mäuse bei 4, 8 und 12 Wochen alt und diabetischen NOD-Mäusen, kurz nach der Diagnose von Diabetes (Blutzucker mehr als 11 mM und Polyurie) sowie NOD.SCID Mäuse 4 Wochen oder als Erwachsene wurden von den erhaltenenUniversity of Western Ontario, London, Ontario, Kanada und in einer keimfreien Umgebung untergebracht. Die Mäuse wurden drei pro Käfig, mit Nahrung und Wasser versorgt ad libitum untergebracht und auf einer 12-Stunden-Licht / Dunkel-Zyklus gehalten. Blutzucker wurde aus einem Schwanz Probe unter Verwendung eines glucometer (Bayer, Elkhart, IN) gemessen. Alle Versuche folgten dem kanadischen Rat für Richtlinien Animal Care und wurden durch den Einsatz von Tieren Unterausschuss, University of Western Ontario genehmigt. Behandlungen komplette Freund-Adjuvans (CFA) wurde von Sigma Aldrich (St. Louis, MO) erworben. Zur Bestimmung der Wirkung von CFA auf Reg2, Reg1, Reg3δ, IL-22 und IL-22-Rezeptor (R) -α-Expression, Mäuse i.p. injiziert wurden entweder mit 100 ul CFA (50 ug / ml) in Kochsalzlösung emulgiert (1: 1) oder mit 100 ul Kochsalzlösung allein für die Kontrolle in 4, 8, 12 Wochen und diabetischen NOD Mäusen. Um die Wirkung von IL-22 Neutralisierung auf Reg Ausdruck bestimmen; drei 5 bis 6 Wochen alte NOD-Mäuse wurden i.p. mit 100 ul CFA mit Kochsalzlösung (1: 1) und anschließend 1 h spätermit 100 ul (i.p.) von 3 mg / ml Ratten-anti-Maus-IL22-01 monoklonalen Antikörper (21) oder Isotyp-passenden Kontrollantikörper (Pfizer). Die Mäuse wurden in einer CO2-Kammer 48 Stunden später für Gewebeentnahme getötet. Gewinnung von Splenozyten und Bauchspeicheldrüse Etwa 50 mg der gesamten Milz oder Pankreasgewebe von NOD / Ltj und NOD.SCID Mäuse wurde in einer Lösung, die Puffer RLT (Qiagen, Mississauga, ON) und 2-Mercaptoethanol (Sigma Aldrich, St. Louis homogenisiert, MO) ein PowerGen 700 Homogenisator (Fisher Scientific, Pittsburgh, PL) verwendet wird. Isolierung von pankreatischen Inseln NOD-Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet. Kalt Kollagenase XI (0,23 mg / ml, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) wurde in der Bauchspeicheldrüse durch den gemeinsamen Gallengang direkt injiziert. Kollagenase bei 37 ° C wurde verwendet, um das Pankreasgewebe zu verdauen. Bindegeweben und die verbleibenden Zellen wurden mit Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) (Invitrogen, Carlsbad, CA), enthaltend 5% (v / v) fötalem Kälberserum (FCS) (HyClone Laboratories, Logan entfernt,UT). Islet Trennung durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Dextran (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) durchgeführt. Zellen an der Grenzfläche von Dextran Gradienten befindet Schichten von 11% und 23% wurden mit einer Pipette und gewaschen in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640. Einzelne Pankreasinseln wurden handverlesen und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad geerntet CA,), ergänzt mit 100 U / ml Streptomycin (GIBCO, Grand Island, NY), 5 & mgr; g / ml Penicillin und 10% (v / v) FCS bei 37 ° C. Kultur von Pankreasinseln Zellen mit IL-22 Pankreasinseln wurden aus jungen (4-6 Wochen alt) NOD-Mäusen isoliert. Sie wurden über Nacht bei 37 ° C, 5% CO2 in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), äquilibriert, 100 U / ml Streptomycin und 5 ug / ml Penicillin und Inseln wurden Hand gepflückt und in 24-Well-Platte verteilt ( ~ 50 Inseln pro Vertiefung) und mit rekombinantem Maus-IL-22 (10 ng / ml oder 50 ng / ml, R & D Systems, Minneapolis, MN) oder mit 2 ml Th17-Zellen behandeltÜberstand aus IL-6 / IL-23-behandelten Splenozyten [15]. Zwei Tage später Inseln wurden für die RNA-Extraktion geerntet. RNA-Extraktion Gesamt-RNA aus isolierten Splenozyten, Pankreas oder Inselzellen wurde aus Homogenaten extrahiert unter Verwendung eines RNeasy Midi Kit (Qiagen, Mississauga, ON). Eine DNase 1-Behandlung Kit (Ambion, Austin, TX) verwendet wurde DNA-Kontamination zu beseitigen. Der RNA-Gehalt wurde durch Messung der Absorption bei 260 nm quantifiziert eine Nanodrop 1000 Spektrophotometer (ND-Produkte, Wilington, DL) und die Integrität der ausgewählten RNA-Proben wurde unter Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromid zur Identifizierung der Anwesenheit der 18S und 28S geprüft rRNA-Banden. Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion etwa 1 bis 5 & mgr; g Gesamt-RNA wurde aus jeder Probe entnommen und revers in cDNA transkribiert unter Verwendung von Oligo dT12-18 Primern aus Superscript III Erststrangsynthese SuperMix für quantitative RT-PCR (Invitrogen, St. Louis, MO ). Die cDNA-Konzentration wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen undbis 225 ng / & mgr; l in Diethylpyrocarbonat Wasser und durch PCR wurde verdünnt, um eine QuantiFast SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Mississauga, ON) mit spezifischen Primern für den REG1, REG2 Reg3δ, IL-22 und IL-22Rα1.25 ul verwendet wird) (Tabelle 1). Die DNA wurde durch PCR in einem Schmelz- / Glühen Programm zweistufigen verstärkt für bis zu 40 Zyklen mit einem Corbett Rotor-Gene 6000 Thermocycler (Corbett Life Sciences, San Francisco, CA). Dieses Thermocycler-Programm bestand darin, die Proben bei 95 ° C für 5 min Vorheizen, für 10 sec bei 95 ° C cycling und 60 ° C für 20 sec, und einer Schmelzphase von 60 bis 95 ° C. β-Actin wurde als Housekeeping-Gen zur relativen Quantifizierung verwendet. Die Effizienz von jedem Satz von Primern wurde von der Standardkurve Methode bestimmt. Tabelle 1. Liste der Gene und Primersequenzen verwendet für qRT-PCR Fluorescence Immunhistochemie zum Nachweis von β-Zell-DNA-Synthese Etwa 50 isolierten Inseln von 5 bis 6 Wochen alte NOD Mäuse wurden vier Vertiefungen einer sechs-Well-Gewebekulturplatte hinzugefügt, und entweder mit 10ng / ml rekombinantem IL-22, wie oben in DMEM-Medium oder in DMEM-Medium allein als Kontrolle für 48 Stunden. Inselchen wurden in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 1 h bei 4 ° C und erneut suspendiert in 2% niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarose (Fisher Scientific) befestigt ist, die zuerst durch Erhitzen auf 80 ° C verflüssigt wurde. Die Inseln eingebettet in Agarose wurden in 70% Ethanol und in Paraffin eingebettet dehydratisiert. Schnitte von 5 & mgr; m wurden geschnitten und montiert auf Glasobjektträger. EdU Färbung wurde mit einem Click-it EdU Zellproliferation (Invitrogen) durchgeführt gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die nicht-spezifische Färbung wurde für 10 Minuten unter Verwendung von Hintergrund Sniper (Biocare Medical, Concord, CA, USA) blockiert, und die Abschnitte über Nacht mit dem primären Antikörper, Anti-Insulin-Maus (1 inkubiert: 2000; Sigma Aldrich, St. Louis, MO von einer 1 h Inkubation) mit sekundärem Antikörper, AlexaFluor 488 Ziege-Anti-Maus (1: 500; Invitrogen). (:, Sigma Aldrich, St. Louis, MO 500 1) Die Zellen wurden mit Kern DAPI zusammen gefärbt. Sechsundzwanzig Kontrolle undsechsundvierzig behandelt Inselchen wurden identifiziert und analysiert und der Prozentsatz der EDU-positive β-Zellen wurde quantifiziert. Um zu bestätigen, Ergebnisse für DNA-Synthese, Diapositive haltigen Abschnitte von 15 weiteren Inseln wurden für Kern Ki / 67 über Nacht gefärbt, um die primären Antikörper verwendet, Maus anti-Ki / 67 (1: 2000; Sigma Aldrich), gefolgt von einer 1 h Inkubation mit sekundärem Antikörper, AlexaFluor 555 Ziege-Anti-Maus (1: 500; Invitrogen). Analyse der Inselabschnitte wurde durch Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt und die Bilder wurden mit Northern Eclipse-Version 7.0-Software (Empix Imaging, Inc., Mississauga, ON, Kanada) analysiert. Die statistische Analyse Normalerweise verteilt Daten wurden mit SPSS Statistik-Software analysiert mit einem One-Way-oder Zwei-Wege-ANOVA und signifikante Änderungen zwischen Variablen wurden mit einem Tukey-Test nachgewiesen. Der α-Wert wurde auf 0,05 festgelegt. Die Autoren Konkurrierende Interesse erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben. Autoren Beitrag TH durchgeführt, die Versuche und schrieb die anfänglicheEntwurf des Manuskripts. BS, DJH und LAF trugen zum Design der Studie. BS und DJH analysiert die Daten und auf das Schreiben des Manuskripts beigetragen. EN, SB, OK und EL-C trugen zur Datenerfassung. Alle Autoren haben gelesen und das Manuskript zu genehmigen. Danksagung Wir danken Frau Brenda Strutt und Jessica Hill für technische Hilfe und Dr. Margery Ma von Pfizer, Cambridge, MA für anti-IL-22-Antikörper. Wir danken auch Dr. Kathleen Hill, Dr. Alexander Timoshenko und Morgan Kleiber für die Unterstützung bei experimentellen Design und Interpretation der Daten. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt. Referenzen Van Belle TL, Coppieters KT, von Herrath MG: Typ-1-Diabetes: Ätiologie, Immunologie und therapeutische Strategien. Physiol Rev 2011, 91: 79-118. PubMed Abstract | Publisher-Volltext OpenURL Mandrup-Poulsen T: Beta Zelltod und Schutz. Ann NY Acad Sci 2003, 1005: 32-42. PubMed Abstract | Publisher-Volltext OpenURL Levetan C:Die Unterschiede zwischen Insel neogenesis und β-Zell-Replikation: Auswirkungen auf die Umkehrung von Typ 1 und 2 Diabetes. J Diabetes 2010, 2: 76-84. 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